Produkter
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR deteksjonssett for 2019-nCoV
Forventet bruk
Dette settet brukes til kvalitativ påvisning av nytt koronavirus (2019-nCoV) ved hjelp av halsprøver, nasofaryngeale prøver, bronkoalveolær skyllevæske og sputum. Deteksjonsresultatet for dette produktet er kun for klinisk referanse, og det bør ikke brukes som eneste bevis for klinisk diagnose og behandling. En omfattende analyse av tilstanden anbefales i kombinasjon med pasientens kliniske manifestasjoner og andre laboratorietester.
Inspeksjonsprinsipp
Settet er basert på ett-trinns RT-PCR-teknologi. Faktisk ble ORF1ab- og N-genene for det nye koronaviruset i 2019 (2019-nCoV) valgt som amplifiseringsmålregioner. Spesifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober er merket med FAM og ORF1ab-prober er merket med HEX) er utviklet for å detektere RNA for det nye koronaviruset i 2019 i prøver. Settet inkluderer også et endogent internt kontrolldeteksjonssystem (intern kontrollgenprobe merket med CY5) for å overvåke prosessen med prøveinnsamling, RNA og PCR-amplifisering, og dermed redusere falske negative resultater.
Hovedkomponenter
| Komponenter | Volum(48T/sett） |
| RT-PCR-reaksjonsløsning | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probeblanding (ORF1ab, N-gen, RNAseP-gen) | 864 µl |
| Negativ kontroll | 1500 µl |
| nCOV positiv kontroll（l ORF1ab N-gen） | 1500 µl |
Egne reagenser: RNA-ekstraksjons- eller rensereagenser. Negativ/positiv kontroll: Den positive kontrollen er RNA som inneholder målfragmentet, mens den negative kontrollen er nukleinsyrefritt vann. Under bruk skal de delta i ekstraksjonen og skal anses som smittsomme. De skal håndteres og kastes i samsvar med relevante forskrifter.
Det interne referansegenet er det humane RnaseP-genet.
Oppbevaringsforhold og utløpsdato
-20 ± 5 ℃, unngå gjentatt frysing og tining mer enn 5 ganger, gyldig i 6 måneder.
Gjeldende instrument
Med FAM / HEX / CY5 og andre flerkanals fluorescerende PCR-instrumenter.
Krav til prøven
1. Gjeldende prøvetyper: halsprøver, nasofaryngeale prøver, bronkoalveolær skyllevæske, sputum.
2. Prøveinnsamling (aseptisk teknikk)
Faryngeal vattpinne: Tørk av mandlene og den bakre faryngeale veggen med to vattpinner samtidig, og senk deretter vattpinnehodet ned i et reagensrør som inneholder prøvetakingsløsningen.
Sputum: Etter at pasienten har en dyp hoste, samles det hostede sputumet opp i et reagensrør med skrukork som inneholder prøvetakingsløsningen; bronkoalveolær skyllevæske: Prøvetaking av helsepersonell. 3. Oppbevaring og transport av prøver
Prøver for virusisolering og RNA-testing bør testes så snart som mulig. Prøver som kan detekteres innen 24 timer kan oppbevares ved 4 ℃; de som ikke kan detekteres innen 24
timer bør lagres ved -70 ℃ eller lavere (hvis det ikke er noen lagringsforhold på -70 ℃, bør de
midlertidig lagret ved -20 ℃ kjøleskap). Prøver bør unngå gjentatt frysing og tining under transport. Prøver bør sendes til laboratoriet så snart som mulig etter innsamling. Hvis prøvene må transporteres over lange avstander, anbefales lagring av tørris.
Testmetoder
1 Prøvebehandling og RNA-ekstraksjon (prøvebehandlingsområde)
Det anbefales å ta 200 μl flytende prøve for RNA-ekstraksjon. For relaterte ekstraksjonstrinn, se instruksjonene for kommersielle RNA-ekstraksjonssett. Både negative og negative
Kontrollene i dette settet var involvert i ekstraksjonen.
2 PCR-reagensklargjøring (område for reagensklargjøring)
2.1 Ta alle komponentene ut av settet, tin og bland ved romtemperatur. Sentrifuger ved 8000 o/min i noen sekunder før bruk. Beregn nødvendig mengde reagenser, og reaksjonssystemet klargjøres som vist i følgende tabell:
| Komponenter | N-porsjon (25 µl system) |
| nCOV primer TaqMan probeblanding | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaksjonsløsning | 2 µl × N |
| *N = antall testede prøver + 1 (negativ kontroll) + 1 (nCOVpositiv kontroll) | |
2.2 Etter at komponentene er grundig blandet, sentrifuger i kort tid slik at all væsken på rørveggen faller ned til bunnen av røret, og fordel deretter 20 µl amplifikasjonssystemet i PCR-røret.
3 Prøvetaking (område for prøveforberedelse)
Tilsett 5 μl av de negative og positive kontrollene etter ekstraksjon. RNA fra prøven som skal testes tilsettes PCR-reaksjonsrøret.
Sett korken godt på røret og sentrifuger ved 8000 o/min i noen sekunder før det overføres til amplifiseringsdeteksjonsområdet.
4 PCR-amplifisering (amplifisert deteksjonsområde)
4.1 Plasser reaksjonsrøret i instrumentets prøvecelle, og angi parametrene som følger:
| scene | Syklus tall | Temperatur(°C) | Tid | samlingnettsted |
| Omvendttranskripsjon | 1 | 42 | 10 minutter | - |
| Pre-denatureringn | 1 | 95 | 1 minutt | - |
| Syklus | 45 | 95 | 15-tallet | - |
| 60 | 30-årene | datainnsamling |
Valg av instrumentdeteksjonskanal: Velg FAM, HEX og CY5-kanalen for fluorescenssignalet. For referansefluorescens NONE, vennligst ikke velg ROX.
5 Resultatanalyse (Se de eksperimentelle instruksjonene for hvert instrument for innstilling)
Lagre resultatene etter reaksjonen. Etter analysen justerer du startverdien, sluttverdien og terskelverdien for grunnlinjen i henhold til bildet (brukeren kan justere i henhold til den faktiske situasjonen, startverdien kan settes til 3~15, sluttverdien kan settes til 5~20, justering) i den logaritmiske grafen. Ved terskelen til vinduet er terskellinjen i den logaritmiske fasen, og forsterkningskurven til den negative kontrollen er en rett linje eller under terskellinjen.
6 Kvalitetskontroll (en prosedyremessig kontroll er inkludert i testen) Negativ kontroll: Ingen åpenbar amplifiseringskurve for FAM-, HEX- og CY5-deteksjonskanaler
COV positiv kontroll: tydelig amplifiseringskurve for FAM- og HEX-deteksjonskanaler, Ct-verdi ≤ 32, men ingen amplifiseringskurve for CY5-kanal;
Kravene ovenfor må oppfylles samtidig i samme eksperiment; ellers er eksperimentet ugyldig og må gjentas.
7 Fastsettelse av resultater.
7.1 Hvis det ikke er noen amplifiseringskurve eller Ct-verdi > 40 i FAM- og HEX-kanalene i testprøven, og det er en amplifiseringskurve i CY5-kanalen, kan det bedømmes at det ikke er noe RNA fra det nye koronaviruset 2019 (2019-nCoV) i prøven;
.2 Hvis testprøven har tydelige amplifiseringskurver i FAM- og HEX-kanalene, og Ct-verdien er ≤40, kan det bedømmes at prøven er positiv for det nye koronaviruset fra 2019 (2019-nCoV).
7.3 Hvis testprøven bare har en tydelig amplifiseringskurve i én kanal med FAM eller HEX, og Ct-verdien er ≤40, og det ikke er noen amplifiseringskurve i den andre kanalen, må resultatene testes på nytt. Hvis testresultatene er konsistente, kan prøven bedømmes som positiv for den nye
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Hvis resultatet av den nye testen er negativt, kan det bedømmes at prøven er negativ for det nye koronaviruset fra 2019 (2019-nCoV).
Positiv vurderingsverdi
ROC-kurvemetoden brukes til å bestemme referanse-CT-verdien for settet, og den interne kontrollreferanseverdien er 40.
Tolkning av testresultater
1. Hvert eksperiment bør testes for negative og positive kontroller. Testresultater kan bare bestemmes når kontrollene oppfyller kravene til kvalitetskontroll.
2. Når FAM- og HEX-deteksjonskanalene er positive, kan resultatet fra CY5-kanalen (intern kontrollkanal) være negativt på grunn av systemkonkurranse.
3. Når det interne kontrollresultatet er negativt, og reagensrørets FAM- og HEX-deteksjonskanaler også er negative, betyr det at systemet er deaktivert eller at operasjonen er feil, og testen er ugyldig. Derfor må prøvene testes på nytt.
